On Rabu, 18 Desember 2013
Tujuan percobaan
Setelah mempelajari teori dan melaksanakan praktek, mahasiswa diharapkan dapat memahami cara menganalisis kadar protein dalam bahan hasil pertanian dan pangan dengan cara semi mikro Kjeldahl.
Dasar percobaan
Analisis protein didasarkan pada:
- Pengukuran jumlah atau kadar N, karena komponen bahan pangan lain spt lemak dan KH tidak mengandung N, dan hanya sedikit komponen yang mengandung N dan dalam kadar rendah
- Reaksi spesifik suatu senyawa/reagen dengan ikatan peptida
- Reaksi spesifik asam amino tertentu dengan suatu reagen (misal metode Lowry: reaksi tirosin dan triptofan dengan fosfotsungtat-fosfomolibdat)
- Reaksi antara protein dengan suatu senyawa seperti metode fenol (protein bereaksi dengan fenol)
- Metode spektrofotometri: absorbsi spesifik protein pada panjang gelombang uv misal 280 nm
- Turbidimetri: berdasarkan kekeruhan
- dll
Bahan percobaan :
Kedelai, kacang tanah, roti, beras, gandum, susu
Alat percobaan :
Alat destruksi, destilasi dan titrasi
A. Penentuan Kadar Protein berdasarkan metode Mikro Kjeldahl
Metoda ini dikembangkan oleh Kjedahl, merupakan peneraan empiris (tidak langsung), yang diukur adalah kadar Nitrogen. Umumnya kadar N dalam protein adalah 16% sehingga kadar protein dalam suatu bahan=kadar N x 100/16, yaitu 6,25 adalah faktor konversi yang umum digunakan. Faktor konversi bisa berbeda tergantung jenis protein dan kadar N dalam protein tsb. Misal: Protein gandum (5,70) ; Protein susu (6,38) ; Gelatin (5,55), beras (5,95) ; kacang tanah (5,46) ; kedelai (5,75) ; makaroni (5,70). Kelemahan dari metoda ini adalah senyawa lain selain protein yang mengandung N terukur sebagai protein. Misal senyawa bernitrogen: asam amino bebas, urea, amonia, asam nukleat, nitrit, nitrat, amida, purin, pirimidin. Oleh karena itu analisis dengan metode Kjedahl disebut analisis protein kasar (crude protein)
Prinsip : terdapat tiga (3) tahapan analisa kadar N total metoda Kjeldahl, yaitu :
1. Dekstrusi :
Dalam proses oksidasi dilakukan pemanasan dengan asam sulfat dan katalisator garam potasium atau natrium. Tujuan melepaskan nitrogen dari protein dengan cara sampel dipanaskan dalam larutan asam sulfat pekat, Unsur C dan H teroksidasi menjadi H20, CO2, CO, Unsur N berubah menjadi amonium sulfat (NH4)2SO4. Asam sulfat juga mendestruksi KH dan lemak yang mempengaruhi jumlah asam sulfat yang dibutuhkan
2. Destilasi
Pada tahap ini amonium sulfat dipecah menjadi ammonia. Amonia yang dibebaskan ditampung dalam larutan asam standar biasanya HCl atau asam borat 4% yang jumlahnya berlebihan
3. Titrasi
Tujuan menentukan kadar N dalam sampel
Kadar Protein = %N x factor koreksi
Cara Kerja :
1. Ambil 10 ml susu atau larutan portein dan masukkan dalam labu takar 100 ml dan encerkan dengan aquades sampai tanda
2. Ambil 10 ml dari larutan ini dan masukkan dalam labu kjeldahl 50 ml dan tambahkan 10 asam sulfat 98% bebas N. Tambahkan 5 gram campuran Na2SO4-HgO (20:1) untuk katalisator
3. Didihkan sampai jernih dan selanjutnya pendidihan 30 menit lagi. Setelah dingin cucilah dinding labu kjeldahl dengan aquades dan didihkan selama 30 menit lagi
4. Setelah dingin ditambahkan 140 ml aquades dan tambahkan 35 ml laruan NaOH-Na2S2O3 dan beberapa butiran zenk
5. Lakukan distilasi, distilat ditampung sebanyak 100 ml dalam erlenmeyer yang berisi larutan jenuh asam borat dan beberapa tetes indikator metil merah/metil biru
6. Titrasilah larutan yang diperoleh dengan 0,02 N HCl
7. Hitunglah total N atau % protein dalam contoh
B. Penentuan Kadar Protein berdasarkan metode Formol
Metode ini digunakan untu mengukur kadar N-amino, dapat digunakan untuk mengukur tingkat hidrolisis protein. Reaksi antara formol dengan gugus amino tetapi tidak dapat membedakan antara gugus amino dengan gugus amin yang lain
Prinsip :
Larutan filtrate yang mengandung protein dinetralkan dengan basa NaOH kemudian ditambah formalin. Formalin akan bereaksi dengan gugus amino dari protein atau asam amino membentuk dimethilol. Gugus karboksil (COOH) dari asam amino akan dititer dengan NaOH sampai titik akhir titrasi terbentuk warna merah muda permanen dengan menggunakan indicator PP.
Cara Kerja :
1. Pipet larutan sampel (susu) ke dalam erlenmeyer 125 mL dan tambahkan 20 mL akuades, 0,4 mL larutan K-oksalat jenuh (K-oksalat : air = 1 : 3) dan 1 mL indicator PP 1%. Diamkan selama 1 menit
2. Titrasi larutan menggunakan 0,1 N NaOH sampai terbentuk warna standar (merah muda). Warna standar : 10 mL susu + 10 mL akuades + 0,4 mL K-oksalat jenuh + 1 tetes 0,01% indicator rosanilin-klorida.
3. Ditambahkan 2 mL larutan formaldehida 40% dan titrasi kembali dengan larutan NaOH sampai warna standar tercapai lagi (catat volume titrasi)
4. Buat titrasi blanko : 20 mL akuades + 0,4 mL larutan K-oksalat jenuh + 1 mL indicator PP + 2 mL larutan formaldehida. Titrasi dengan NaOH
5. Titrasi terkoreksi yaitu titrasi kedua dikurangi titrasi blanko merupakan titrasi formol. Untuk mengetahui % protein, harus dibuat percobaan serupa dengan menggunakan larutan yang telah diketahui kadar proteinnya (missal dengan cara Kjeldahl).
6. Untuk susu dapat digunakan factor 1,83 :
% protein susu = 1,83 x mL titrasi formol
% kasein = 1,63 x mL titrasi formol
