On Rabu, 18 Desember 2013
Tujuan percobaan
Setelah mempelajari teori dan melaksanakan praktek, mahasiswa diharapkan dapat memahami cara menganalisis komponen kimia dalam bahan hasil pertanian dan pangan dengan menggunakan kromatografi kolom.
Dasar percobaan
Pada umumnya, bahwa kromatografi kolom dilaksanakan dalam sebuah kolom yang berisi dengan fase stasioner yang mempunyai porositas tertentu. Cairan yang membawa senyawa yang akan dipisahkan sebagai fase mobil yang bergerak didalam kolom yang telah berisi fase stasioner. Kromatografi kolom ini dapat dibagi menjadi empat jenis yaitu kromatografi adsorbsi, kromatografi partisi, kromatografi penukar ion dan kromatografi filtrasi gel. Kromatografi adsorbsi senyawa yang dipisahkan berlangsung secara selektif denan teradsorbsi pada permukaan adsorben yang ada di dalam kolom. Kromatografi partisi pemisahan secara selektif yang mengalami partisi antara lapisan cairan tipis pada penyangga padat yang bertindak sebagai fase stasioner dan eluennya yang bertindak sebagai fase mobil. Kromatografi penukar ion memisahkan komponen yang berbentuk ion yang nantinya akan terikat pada penukar ion yang berfungsi sebagai fase stasioner secara selektif akan terlepasdari fase mobil. Kromatografi filtrasi gel yang permeabel sebagai fase stasioner dan pemisahan terjadi seperti orang mengayak yaitu berdasarkan ukuran molekuldari komponen yang dipisahkan.
Kromatografi adsorbsi
Kromatografi adsorbsi menggunakan zat padat sebagai adsorben yang berfungsi sebagai fase stasioner dan fase mobilnya menggunakan zat cair. Permukaan partikel adsorben pada umumnya lebih aktif dari pada bagian dalamnya. Pada saat partikel dimasukkan dalam pelarut, maka permukaan partikel mempunyai daya tarik baik pada zat-zat yang terlarut maupun pada zat pelarutnya. Daya tarik tersebut dapat bersifat elektrostatik atau ionik, daya tarik antar dua dipol, antara dipol dan dipol induksi dan karena daya vander waals. Agar daya tarik tersebut tinggi maka diperlukan permukaan yang luas.
Apabila larutan mengalir melalui permukaan partikel yang aktif, maka terjadi proses adsorbi dan desorbsi yang berhubungan antara konsentrasi larutan (Kl) dan bahan yang teradsorbsi (Kp) dapat digambarkan sebagaimana Gambar 1. kurva yang menghubungkan antara Kl dan Kp dinamakan kurva isoterm adsorbsi. Kedua hubungan ini dapat membentuk tiga hubungan
Acara 1. Penentuan Kadar tokoferol dalam minyak
Bahan kimia :
· Etanol absolut
· Heksan
· Larutan bathophenantrolin : 193,4 mg dilarutkan dalam 100 ml etanol absolut
· Larutan ferri klorida heksa hidrat dilarutkan dalam 100 ml etanol absolut dan disimpan dalam botol berwarna
· Larutan asam fosfat :0,69 ml 86% asam fosfat dilarutkan dalam 100ml etanol absolut
· Alumina yang telah diaktivasi sesuai untuk kromatografi kolom, 100-200 mesh
Prosedur kerja
1. Timbang sekitar 0,1 gr sampel minyak dan larutkan dalam 5 ml heksan
2. Kromatografi dilaksanakan dalam pipa kaca (ukuran 8 x 200 mm) bagian bawahnya ditutup dengan glas wool, seterusnya diisi 2,5 gr alumina dengan vibrator. Bagian atas juga ditutup dengan glas wool. Kolom dipersiapkan dengan mengelusi beberapa kali dengan pelarut. Masing-masing elusi dikerjakan setelah pelarut dari elusi sebelumnya keluar.
3. Kolom mula-mula dikondisikan dengan 3 ml 2% aseton dalam heksan (v/v).diikuti dengan 5 ml heksan ke dalam kolom.
4. 5 ml larutan minyak dalam heksan diaplikasikan ke dalam kolom.
5. Dialirkan melalui dinding kolom 1 ml , 2% aseton dalam heksan (v/v). Senyawa pengganggu dielusi dengan 10 ml dengan pelarut yang sama diikuti dengan 2 ml, 20% etanol absolut dalam heksan. Eluatnya dibuang. Senyawa pengganggu telah semuanya terelusi, bila tambahan elusi dengan pelarut yang sama tidak menghasilkan warna merah dengan larutan bathophenantrolin dan feriklorida.
6. Tempatkan labu volumetrik 10 ml di bawah kolom. Tuangkan ke dalam kolom 8,5 ml 20% etanol absolut dalam heksan untuk mengelusi tokoferol. Kumpulkan eluatnya. Sempurnakan elusi tokoferol dapat di cek dengan penambahan 20% etanol absolut dalam heksan, bila tidak memberikan warna merah pada larutan bathophenantrolin dan feriklorida.
Pembentukan warna
1. Pembentukan warna dikerjakan dengan memberikan reagensia pada eluat yang ada dalam labu volumetrik yaitu 0,5 ml larutan feriklorida setelah 2 menit dengan 0,5 ml larutan asam folat
2. Seterusnya volume sampel dijadikan 10 ml dengan menabahkan 20% larutan etanol absolut dalam heksan
3. Baca besarnya absorbansi pada panjang gelombang 534 nm, 20-30 menit setelah asam folat ditambahkan. Blanko dikerjakan dengan cara sama kecuali sampel 5 ml heksan tidak mengandung minyak.
